СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ ТОЧНОСТИ РАДИОИММУНОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

В.А Викторов, А.С. Кауфман, Д.Х. Ли, О.В. Северин, В.Ф. Севостьяненко

ЗАО ВНИИМП-ВИТА.
125422, РФ, Москва, Тимирязевская ул.,1, тел 211-48-22

Методы радиоиммунохимического анализа широко применяются для количественного определения свыше 600 химических веществ различной природы, как с целью диагностики, контроля лечения и профилактики различных заболеваний человека и животных, так и при научных исследованиях в области медицины и биологии. Наиболее широкое распространение получил метод радиоиммунохимического анализа с использованием йода-125, заключающийся в приготовлении реакционной смеси, ее инкубации, выделении продуктов реакции, определении суммарной интенсивности фотонного излучения, регистрируемого с помощью сцинтилляционного детектора в выделенных продуктах реакции, построении калибровочной кривой анализа, по которой находят количественное содержание определяемого вещества в пробе.

На этапе выделения подуктов реакции получают ряд пробирок, содержащих меченые продукты реакции, как правило, иммобилизованные на стенках этих пробирок. Количество продуктов реакции в той или иной пробирке обратно пропорционально содержанию определяемого вещества, внесенного в данную пробирку. Однако, при существующих технологиях формирование продуктов реакции происходит неравномерно по поверхности пробирки. Это явление – неоднозначность положения (распределения) продуктов реакции в пробирке присуще всем модификациям радиоиммунохимического анализа, использующим в качестве выделенных продуктов реакции твердую фазу – т.е. всем современным модификациям анализа.

Далее в каждой из пробирок производят определение суммарной интенсивности фотонного излучения, регистрируемого с помощью сцинтилляционного детектора. Эта технология применяется во всех устройствах для реализации радиоиммунохимического анализа, а сам детектор выполняется на основе монокристалла NaI (Tl).

Распад йода-125 происходит посредством К-захвата (в 100% актов распада). При распаде излучаются либо фотоны характеристического рентгеновского излучения с энергиями Кa = 27 кэВ или Кb = 31 кэВ (в 82% случаев К-захвата), либо при захвате электрона с оболочек L, М, ….. (18% случаев) фотоны с энергией около 4 кэВ, которые полностью поглощаются лучевым окном и другими элементами сцинтилляционного детектора и не регистрируются. Ядро дочернего атома - теллура-125 находится в возбужденном состоянии с периодом полураспада этого состояния 1,6 нс. Переход этого ядра в стабильное состояние происходит либо путем излучения гамма-кванта с энергией 35,4 кэВ в 7% случаев, либо путем внутренней конверсии, в ходе которой при замещении образовавшихся вакансий в электронных оболочках излучаются фотоны с энергиями, соответствующими уровням Кa или Кb (соответственно 27 и 31 кэВ).

Учитывая свойства сцинтилляционного детектора NaI, а именно разрешающую способность во времени и вышеуказанный энергетический порог получим, что приборный спектр фотонного излучения йода-125 имеет два пика. Пик в области меньших энергий обусловлен фотонами с энергиями 27, 31 и 35.4 кэВ. Пик в области больших энергий вызван парами фотонов с энергиями 35,4 и 27 кэВ, или 35,4 и 31 кэВ, или 27 и 27 кэВ, или 27 и 31 кэВ (регистрируемых, как совпадающие во времени из-за недостаточного временного разрешения сцинтилляционного детектора).

При традиционной реализации радиоиммунохимического анализа определяют суммарную интенсивность фотонного излучения, т.е. суммарное количество событий, зарегистрированных в первом и втором пиках. Тем самым преследуется цель обеспечить регистрацию практически всех фотонов, попавших в чувствительный объем детектора. Однако количество фотонов попавших в чувствительный объем детектора зависит от взаиморасположения продуктов реакции и детектора, таким образом, вышеуказанная неоднозначность положения (распределения) продуктов реакции в пробирках опосредуется детектором и приводит к позиционной погрешности определения интенсивности суммарного фотонного излучения в пробе. Исключить указанную погрешность, непосредственно влияющую на точность анализа, теоретически возможно регистрируя фотоны, излученные исследуемой пробой в телесный угол равный 4p. Однако на практике создание такого детектора с истинной 4p-геометрией и полным сбором фотонного излучения пробы, независимо от геометрических особенностей распределения продуктов реакции в пробе, не представляется возможным. Реально ограничиваются колодезными конструкциями детекторов, регистрирующих 80-85% фотонного излучения точечной пробы, расположенной на дне колодца. При этом позиционная погрешность для стандартных конструкций таких детекторов, применяемых в установках для радиоиммунохимического анализа составляет 12-15%.

Полученные данные о суммарной интенсивности фотонного излучения в каждой из пробирок используют для построения калибровочной кривой анализа, с помощью которой находят количественное содержание определяемого вещества в исследуемых пробах.

Ошибки в определении суммарного фотонного излучения в выделенных продуктах реакции приводят к искажению результатов анализа – снижению его точности. При этом, рассматриваемый источник погрешности один из основных факторов, ограничивающих точность радиоиммунохимического анализа. Недостаточная точность анализа особенно проявляется в пологих областях калибровочной кривой, где незначительные погрешности в определении интенсивности излучения приводят к существенной погрешности в количественной оценке содержания определяемого вещества в пробе.

Влияние позиционной погрешности на результат анализа снижают путем постановки анализа с использованием нескольких репликатов одной и той же пробы и усреднением полученных результатов. Однако этот путь сопровождается расходом реагентов, трудозатрат и удорожает анализ. Наличие позиционной погрешности приводит также к недостаточности динамического диапазона анализа, поскольку для расширения диапазона измерения содержания определяемого вещества необходимо увеличивать площадь пробирки, на которой иммобилизовывается связывающая система, а это сопровождается резким увеличением позиционной погрешности. Другой путь расширения динамического диапазона – анализ в области пологой части калибровочной кривой также неприемлем без снижения позиционной погрешности.

Вышеописанный метод радиоиммунохимического анализа имеет множество модификаций, касающихся используемых реагентов, последовательности внесения реагентов и проб при приготовлении реакционной смеси, способов выделения продуктов реакции, способов построения калибровочной кривой, не изменяющих данный метод анализа по существу.

Предложенный способ решает задачи повышения точности радиоиммунохимического анализа, расширения динамического диапазона анализа и снижения его стоимости путем исключения влияния неоднозначности положения (распределения) выделенных продуктов реакции в пробирке на результат анализа. Это достигается тем, что с помощью сцинтилляционного детектора в выделенных продуктах реакции определяют интенсивность Аоф однофотонного излучения и интенсивность Ас временных совпадений излучаемых фотонов затем рассчитывают параметр G по формуле:

G = (Aоф +2Ас)2 / Ас,

который используют при построении калибровочной кривой.

Сущность способа поясняется ниже.

В ходе анализа получают ряд пробирок, содержащих выделенные продукты реакции, иммобилизованные на стенках этих пробирок.

Далее в каждой из пробирок с помощью сцинтилляционного детектора определяют интенсивность однофотонного излучения и интенсивность временных совпадений излучаемых фотонов. Этот процесс выполняют, например, с помощью установки для радиоиммунохимического анализа седьмого поколения “ПОЛИТЕСТ-2000”. Установка содержит 12 сцинтилляционных детекторов, так что одновременно измеряется 12 проб, помещенных каждая в свой детектор. Сигналы детекторов подвергаются амплитудной селекции и последующему подсчету. Таким образом, определяется интенсивность однофотонного излучения (площадь пика в области меньших энергий) и интенсивность временных совпадений излучаемых фотонов (площадь пика в области больших энергий). Пусть А - суммарная интенсивность излучения фотонов в телесный угол 4p в продуктах реакции, содержащихся в какой-либо пробирке (рассматриваем только те фотоны энергия, которых позволяет зарегистрировать их сцинтилляционным детектором). Обозначим доли фотонного излучения, попавшего в чувствительный объем детектора и зарегистрированного в нем, как q1, q2 и q3 для фотонов с энергиями 27, 31, 35,4 кэВ соответственно. Ввиду близости энергий этих фотонов величины q1, q2 и q3 различаются между собой менее чем на 1% (для реальных конструкций сцинтилляционных детекторов), поэтому можно принять q1 = q2 = q3 = q. Величина q существенно зависит от распределения выделенных продуктов реакции в пробирке (от взаиморасположения этих продуктов и детектора) и эта зависимость предопределяет величину позиционной ошибки. Обозначим вероятность излучения фотона в ходе К-захвата как р1, а вероятность излучения фотона в ходе распада возбужденного ядра теллура-125 (гамма-излучение возбужденного ядра или излучение при заполнении вакансий в электронных оболочках) как р2.

Тогда интенсивность А1 регистрируемого однофотонного излучения при К-захвате будет:

А1 = qp1A - q2p1p2A,

где q2p1p2A - учитывает долю совпадающих событий.

Аналогично интенсивность А2 регистрируемого однофотонного излучения в ходе распада возбужденного ядра теллура-125 будет:

А2 = qp2A - q2p1p2A

Интенсивность Аоф регистрируемого однофотонного излучения составит тем самым:

Аоф = А1+А2 = qp1A + qp2A - 2q2p1p2A ; (1)

Интенсивность Ас временных совпадений излучаемых фотонов составит:

Ас = q2p1p2A; (2)

Решение системы уравнений (1), (2) относительно А дает:

А = (р1р2/(р1 + р2)2) [(Aоф +2Ас)2 / Ас] (3)

Иначе А = КG, где

К = р1р2/(р1 + р2)2 ;

G = (Aоф +2Ас)2 / Ас ; (4)

Величина А, расчитанная по формуле (3), не зависит от значения q и тем самым не зависит от распределения выделенных продуктов реакции в пробирке (взаиморасположения выделенных продуктов и детектора). Учитывая, что К - константа ( можно показать, что значение К » 0,92) величина G также не зависит от значения q и тем самым не зависит от распределения выделенных продуктов реакции в пробирке.

Калибровочная зависимость строится на основании значений G, вычисленных по формуле (4) для проб с известным содержанием вещества по измеренным для каждой из этих проб величинам Aоф и Ас.

Далее, как обычно, с помощью построенной калибровочной зависимости находят содержание определяемого вещества в каждой из исследуемых проб, используя значения G, вычисленные для этих проб.

Проведенные испытания полностью подтвердили преимущества данного способа перед известным. Так, существенно повышается точность анализа: снижается коэффициент вариации между репликатами пробы. Это можно характеризовать следующими значениями, в частности, коэффициент вариации между 20 репликатами референтных проб (воспроизводимость внутри анализа) для анализа эстрадиола при реализации известного способа на установке “Политест-2000” составил для проб с содержанием эстрадиола 5,2; 360; 4600 пг/мл соответственно 12,3; 7,6 и 14,8%, а при анализе тех же проб на той же установке, но в режиме реализации предлагаемого способа 3,2; 2,3 и 3,8 %

При анализе с использованием 6 различных серий данного диагностического набора были получены следующие величины коэффициента вариации (воспроизводимость между анализами) соответственно для известного способа 15,2; 12,1; 19,6% и для предложенного - 4,8; 3,5; 5,2%.

Столь существенное уменьшение коэффициента вариации позволяет реально отказаться от репликации проб при проведении анализа, что приводит к существенному снижению стоимости анализа. Значительное снижение коэффициента вариации в области как низких так и, особенно, высоких концентраций позволяет расширить динамический диапазон анализа, как на стадии измерения проб, так и на стадии изготовления диагностического набора, поскольку на этой стадии становится возможным увеличить поверхность иммобилизации связывающего агента на стенке пробирки.

Проведенный эксперимент показал, что при существенном изменении взаиморасположения пробирки с продуктами реакции и сцинтилляционного детектора (пробирка приподнималась на 20 мм (!!!) над дном колодца детектора глубиной 37 мм), результат анализа при концентрации эстрадиола в пробе 360пг/мл изменялся менее чем на 1,5% в предлагаемом способе и в 2,2 раза (!!!) в известном.

Содержание конференции | Секция5