СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА СТАНДАРТНЫХ НАБОРОВ ИММУННО-ФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ ЭРИТРОПОЭТИНА КРОВИ.

О.Н. Камушкина, В.И. Глобин

НИИ детской гематологии, Рязанский филиал
390029, Россия, г. Рязань, ул. Строителей, 5”В “, тел. (0912) 28-68-64
E-mail: office@hematolog.ryazan.ru

Широкое распространение методов иммуноферментного анализа (ифа) для качественного и количественного определения биологически активных веществ в биосубстратах диктует необходимость обеспечения определенного уровня унификации исследований, что обусловливает появление соответствующих требований к тест-системам, производимым различными фирмами. В докладе комитета экспертов воз по биологической стандартизации сформулирован перечень рекомендуемых критериев для оценки качества диагностических наборов (1), среди которых были упомянуты: точность, воспроизводимость; оценка параллелизма результатов измерения анализируемого вещества и калибрователя; сопоставление результатов определения анализируемого вещества, полученных разными методами. Исходя из этого, тест-системы для ифа должны характеризоваться: правильностью, чувствительностью, воспроизводимостью, специфичностью (2). Представляемые на российском рынке тест-системы, в особенности отечественного производства, не всегда отвечают вышеуказанным критериям, а также не содержат достаточной информации о характеристических особенностях наборов.

В настоящем исследовании проведена сравнительная оценка диагностических наборов для ифа, используемых при определении уровня в крови регулятора эритропоэза – гормона эритропоэтина (еро). Изучение содержания эритропоэтина в крови играет существенную роль не только при патологических состояниях для выяснения причин и механизмов нарушения эритропоэза, ведущих к развитию анемий и полицитемий, но и используется в качестве теста допинг-контроля при проведении спортивных состязаний, в частности на олимпиаде-2000.

Материалы и методы исследования.

При диагностических обследованиях контингентов больных различного пола и возраста использовались следующие тест-системы:
  1. “erythropoietin – elisa”(elisa-еро) фирмы ibl (гамбург, германия);
  2. “рrocon epo 24” и “procon epo plus” фирмы “протеиновый контур” (с.-петербург, россия).

Все они снабжены паспортом-инструкцией с указанием принципа метода, условий хранения, информацией о сборе и подготовке образцов, комплекте поставки, мерах безопасности, дополнительном оборудовании и стандартным протоколом анализа.

Помимо этого, в паспортах к наборам фирмы ibl (германия) включена информация о специфических характеристиках теста: ожидаемых значениях, специфичности (в частности отмечается, что не наблюдается перекрестных реакций в широком интервале концентраций с человеческим трансферрином, человеческим igg, ил-2, паратгормоном, кальцитонином), чувствительности (нижний предел чувствительности ниже 2 мu/мл), точности, линейности (воспроизводимости при разведении образцов), выходе (воспроизводимости при добавлении еро). Стандарт набора erythropoietin-elisa был откалиброван по международному референcному стандарту воз 2nd irp, hum urinary/bloassy 67/343/. Правильность калибровки оценивается с помощью входящих в набор 2х контрольных сывороток с определенными концентрациями эритропоэтина.

В отличие от этого, в инструкциях к наборам фирмы “протеиновый контур” не содержится информации о показателях качества тест-системы, ее специфичности, чувствительности, точности и соответствии стандартов референтным значениям. В комплект набора не включены контрольные материалы.

Вышеуказанные тест-системы предназначены для твердофазного иммуноферментного анализа по принципу “sandwisch”. Индикаторными компонентами являются коньюгат пероксидазы хрена со стрептавидином (в наборах procon), или козьи антитела к биотину, меченные щелочной фосфатазой (в наборе erythropoietin-elisa). В качестве субстратов применяются пара-нитрофенилфосфат для щелочной фосфатазы, и тетра-метилбензидин для пероксидазы, при этом интенсивность развивающегося окрашивания прямо пропорциональна концентрации эритропоэтина в образце. Учет результатов производился при длине волны 450 нм (для наборов pro-con) или 405 нм (для набора elisa-еро). Для измерения оптической плотности в лунках планшета использовали автоматический ифа-ридер elx800 фирмы bio-tek instruments (сша), представляющий собой одноканальный фотометр для выполнения анализа по конечной точке с волновым диапозоном 400-750 нм.

Результаты и обсуждение.

Нами было проведено 390 исследований уровня эритропоэтина в сыворотке крови больных с разными формами анемий. Из них набором erythropoietin-elisa - 250, набором pro-con 24 – 60, и набором pro-con plus – 80 определений.

Для установления точности тест-систем использовали контрольные сыворотки, входящие в состав набора elisa-еро, с референтно определенными значениями: для контроля №1 – 9,9 mu/ml (8,2-13,4 mu/ml), для контроля №2 – 17,9 mu/ml (14,6-23,9 mu/ml). Параллельно, с построением калибровочной кривой при помощи стандартов, было поставлено 10 опытов с каждой из контрольных сывороток в одной постановке во всех тест-системах и 12 опытов в независимых постановках набором еlisa-еро. Полученные результаты сведены в таблицах 1, 2 и 3, где s-стандартное квадратичное отклонение, cv-коэффициент вариации, m-стандартная ошибка средней.

Таб.1. Вариации результатов внутри опыта (тест-система elisa-еро)

Материал n Х ср, мu/мл S m Cv, %
Контроль 1 10 9,2 0,11 0,03 1,2
Контроль 2 10 17,4 0,57 0,18 3,3


Таб. 2. Вариации результатов от опыта к опыту (тест-система elisa-epo)

Материал N Хср, мu/мл S m Cv, %
Контроль 1 12 10,8 0,73 0,21 6,8
Контроль 2 12 19,8 1,3 0,38 6,5


Таб. 3. Вариации результатов внутри опыта (тест-система pro-сon plus)

Материал N Х ср,мu/мл S m Cv,%
Контроль 1 10 10,4 0,67 0,4 6,5
Контроль 2 10 20,1 1,4 0,8 7,1

В отличии от вышеуказанных тест-систем, построение калибровочной кривой при работе с набором pro-соn 24 вызвало затруднение вследствие сильного разброса результатов промежуточных значений стандартов эритропоэтина, контроль точности провести не удалось.

Для контроля воспроизводимости исследовали сливную сыворотку и использовали постановку параллельных проб(3). Полученные результаты представлены в таблицах 4 и 5.


Таб. 4. Воспроизводимость результатов (тест-система elisa-еро)

Материал n Х ср, мu/мл S m Cv,%
Слив.сыворотка 1 10 63,3 2,1 0,66 3,3
Слив.сыворотка 2 10 18,9 1,7 0,53 8,9

Наблюдалась высокая степень воспроизводимости (результаты анализов из опыта в опыт не выходили за границы 2s) и сходимость результатов в дублях: s=0,56.


Таб.5. Воспроизводимость результатов (тест-система рro-соn plus)

Материал n Х ср,мu/мл S m Cv,%
Слив.сыворотка. 1 10 68,4 9,7 3,1 14,3
Слив.сыворотка. 2 10 22,1 4,5 1,1 20,4

Метод параллельных проб показал высокую сходимость результатов исследования:s=0,86.

Достоверной разницы между коэффициентами вариации, полученными по контрольным сывороткам не выявлено (cvelisa-1=1,2; cvрro-cоn-1=6,5; t=1,185 сvelisa-2=3,3; cvpro-con-2=7,1; t=0,850), но cvelisa < cvpro-соn. Различия коэффициентов вариации, полученных по сливным сывороткам, достоверны (cvelisa-1 = 3,3; cvpro-соn-1 = 14,3; t = 2,460; p < 0,05; cvelisa-2 = 8,9; сvpro-соn-2=20,4; t=2,572; р<0,05). В методе параллельных проб selisa < sрro-соn. Можно предположить, что тест-система elisa-еро более адаптированна к работе с реальными образцами сыворотки.

При оценке воспроизводимости результатов, полученных набором pro-соn24 наблюдался разброс измерений от опыта к опыту, воспроизводимость в дублях удовлетворительная.

Проводили параллельные исследования концентраций еро в сыворотках одних и тех же больных методом ифа в разных тест-системах. Полученные результаты оценивали методом параллельных проб.


Таб.6. Cходимость результатов в разных тест-системах.

n Elisa-еро,мu/мл Рro-соn plus, мu/мл S m
Разности		 p
5 60,0 70,0 7,5 3,4 <0,01
120,0 110,0
30,0 35,0
2,0 2,0
8,0 9,4

Наблюдается высокая степень сходимости результатов, полученных наборами elisa-еро и prо-соn plus.

Проведенные исследования показывают, что в силу высокой достоверности результатов при определении точности и воспроизводимости, а также простоты методики, тест-систему elisa-еро можно использовать для сравнения с другими тест-системами в качестве референтной для определения уровня эритропоэтина в сыворотке крови.

Отечественные диагностические наборы нового поколения рro-соn plus также обладают хорошей воспроизводимостью и точностью, что делает их конкурентноспособными, тем более что они доступнее по стоимости. Это позволяет применять их не только в научных целях, но и при массовых обледованиях пациентов.

Литература

  1. Who expert committee on biological standartization. World health organization technical report series 658/33.- Geneva, 1981.
  2. Медицинская лабораторная диагностика: программы и алгоритмы.- С.-петербург “интермедика”,1997.
  3. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник. Под ред. Проф. В.в.меньшикова.- Москва “медицина”,1987.

Содержание конференции | Секция5