РАЗРАБОТКА ИММУНОФЕРМЕНТНОГО МЕТОДА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА В 12 И ФОЛИЕВОЙ КИСЛОТЫ

А.А. Левина, Н.С. Мелик-Нубаров, Т.В. Казюкова, Н.С. Кузьмина, Н.В. Цветаева

Гематологический Научный Центр РАМН, отделение химиотерапии лейкозов,
125167, Москва, Новозыковский проезд, д.4А
Московский государственный университет, химический ф-т, кафедра ВМС.
Москва, 119899 гсп, Ленинские горы,
МГУ

Витамин В 12 и фолаты являются необходимыми компонентами при синтезе ДНК. Поэтому дефицит этих витаминов может вызывать нарушения в продукции, созревании и функциональном состоянии эритроцитов и лейкоцитов, вызывая мегалобластную анемию, с одной стороны, и изменения в нейропсихологических реакциях, с другой, причем последние могут проявляться независимо от наличия анемии. Витамин В12 синтезируется только микроорганизмами и поступает в организм человека и животных с мясной пищей. За всасывание витамина В12 ответственен внутренний “intrinsic” фактор в пищеварительном тракте. При его дефиците или отсутствии возникает пернициозная анемия. Источником фолатов являются овощи, фрукты и печень.

Структурно витамин В12 относится к кобаламинам, в состав которых входит корриновое кольцо, в центре которого находится атом кобальта, верхний лиганд, ковалентно связанный с кобальтом, и нуклеотидная боковая цепь. Фолиевая кислота относится к птероглютаминовым кислотам. Как витамин В12, так и фолаты имеют много дериватов. Среди известных витаминов кобаламины занимают первое место по структурной сложности и разнообразию, а по концентрации в организме - последнее. Однако, реакции, в которых они принимают участие, крайне важны для нормального метаболизма животных организмов. Это, прежде всего, реакция переноса метильных групп на гомоцистеин и участие в синтезе метионинсинтетазы, которая является одним из звеньев в каскаде реакций, ответственных за проведение нервных импульсов, а также реакция мутазного типа по превращению метилмеланила-КоА в сукцинил-КоА - ключевой стадии в метаболитических, и синтетических реакциях.

В связи с вышеуказанным, количественное определение витамина В12 и фолатов существенно как для гематологии, так и неврологии при проведения дифференциальной диагностики, назначении адекватной терапии и динамических наблюдений.

Поскольку содержание кобаламинов и фолатов в организме крайне незначительно, определение их возможно только современными высокочувствительными методами - радиоиммунными, энзимоиммунными и иммунофлюоресцентными. Большинство наборов, выпускаемых фирмами в данное время, приспособлено для автоматизированных “закрытых” систем и очень дороги, поэтому разработка относительно недорогого иммуноферментного метода, приспособленного для “открытой” системы, является весьма актуальной проблемой.

Мы решили применить твердофазный иммуноферментный метод, используя моноклональные антитела против витамина В12 и фолиевой кислоты производства фирмы Sigma.

Поскольку как витамин В12, так и фолаты являются гаптенами, для проведения иммуноэнзимного анализа требовалось получение конъюгатов этих соединений с бычьим сывороточным альбумином.

Получение конъюгатов проводили карбодиимидным методом. Для конъюгата витамина В12 использовали его карбоксильное производное, любезно предоставленное нам Рудаковой И.П., а для фолатов - фолиевую кислоту. Ниже мы приводим описание метода по получению конъюгатой Альб-В12 и Альб-фолат.

10 мг фолиевой кислоты (17,6мкмоль) и 10 мг карбоксилатного производного цианкобаламина (7 мкмоль) растворяли каждый в 2 мл абсолютного диметилформамида, и добавляли по 2 мг дициклогексилкарбодиимида(10 мкмоль) и по 5 мг N-гидроксисукцинимида(43 мкмоль). Реакционную смесь инкубировали в темноте в течение 3-х суток в случае фолиевой кислоты и 2-х - витамина В12 до выпадения кристаллов дициклогексилмочевины. Затем супернатант, содержащий N-гидроксисукцинимидилфолат добавляли к 20 мл раствора БСА (2,5мг/мл), а супернатант с N-гидрокси-сукцинимидилкобаламином - к 6,5 мл раствора БСА(10 мг/мл) в 0,1 М карбонатном буфере, рН 9,2. Реакцию конъюгирования проводили в течение 6 часов при комнатной температуре в темноте, после чего конъюгат диализовали в темноте при 4°С против 0,01М трис-хлоридного буфера, рН 7,2, содержащего 0,15М хлорида натрия для удаления несвязавшихся продуктов реакции( соответственно фолиевой кислоты и цианкобаламина). Степень модификации БСА фолиевой кислотой определяли спектрофотометрически, используя молярный коэффициент экстинкций 29100 М ^-1 см ^-1 при длине волны 297 нм. Она составляла 3 остатка на моль белка. Степень модификации БСА цианкобаламином определяли также спектрофотометрически, используя коэффициент экстинкции 8700 М ^-1 см ^-1 при l=550 нм. В нашем случае она составила 0,3 моля на моль белка.

Твердофазным носителем служили иммунологические планшеты фирмы Nunk, которые были сенсибилизированы растворами конъюгатов. Стандартные растворы получали из конъюгатов Альб-В12 и Альб-фолат, определяя их концентрацию спектрофотометрически, как указано выше. В данных системах был применен непрямой конкурентный метод иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител против витамина В12 и фолиевой кислоты. Количество связавшихся антител определяли, используя конъюгат анти-IgG человека с пероксидазой хрена /анти-IgG-ПХ/, по его связыванию с твердой фазой. Субстратом реакции служил ТМВ.

Была проведена работа по подбору эквивалентных концентраций всех реагентов, участвующих в реакции.

Ниже мы приводим условия постановки реакции с указанием подобранных разведений для всех реагентов.

Сенсибилизацию планшетов проводили конъюгатами Альб-В12 и Альб-фолат в разведении 1:20 в фосфатном буфере с БСА /ФБС/ в течение первых 3-х часов при 37 ⁰С, а затем в течение ночи в холодильнике. Затем планшеты были отмыты несколько раз ФСБ. Антигены, т.е. стандартные растворы и испытуемые образцы, предварительно прогревали при 100 ⁰С в растворе 0,3N NaOH с KCN и с дитиотретолом/ДТТ/ для перевода всех дериватов кобаламинов и фолатов в циан-форму и предотвращения денатурации при кипячении. Использовали следующие концентрации стандартных растворов: 1300 пг/мл, 650 пг/мл, 300 пг/мл, 150 пг/мл и 75 пг/мл - для витамина В12 и 20нг/мл, 10нг/мл, 5нг/мл и 2,5нг/мл - для фолатов.

Стандартные растворы и испытуемые образцы - 0,1 мл - помещали в специальные пробирки и добавляли по 0,1 мл раствора NaOH(0,3 N) c KCN(1мг/мл) и ДТТ (50мкл ДТТ на 6 мл раствора щелочи). Пробирки закрывали крышечками из фольги и помещали на 10 мин в кипящую водяную баню. Затем все пробы охлаждали и вносили по 0,1 мл в сенсибилизированные планшеты. Реакцию проводили в течение 12-14 часов при 4-6⁰ , после чего планшеты снова отмывали, а затем вносили соответственно по 0,1 мл антител против витамина В12 в разведении 1:1000 и 0,1 мл антител против фолиевой кислоты в разведении 1:500. Планшеты снова помещали в холодильник на 12-14 часов, после чего их в очередной раз отмывали ФСБ. Затем во все лунки планшета вносили по 0,1 мл анти-IgG-ПХ в разведении 1:10000 и помещали в термостат на 2 часа, снова отмывали ФСБ и затем добавляли по 0,1 мл ТМВ, а после развития окраски через 10-15 мин реакцию закрепляли 4% H₂SO₄. Результаты спектрофотометрировали на приборе Titertek Multiskan при l450 nm. На основании стандартных разведений строили кривую, по которой затем определяли концентрации исследуемых соединений в испытуемых образцах.

Ниже приведены стандартные кривые, полученные при использовании разработанного нами метода. Для проверки набора мы использовали также фирменные стандартные разведения, любезно предоставленные нам Деминой Д.Г. Кривая с фирменными разведениями аналогична кривой с нашими реактивами (рис.1,2).

Рисунок 1.

Рисунок 2

Проверка набора по контрольным сывороткам также дала положительные результаты: в сыворотке с содержанием витамина В12 900- 1000 пг/мл получено значение 1200 пг/мл, а в сыворотке с уровнем В12 200-250 пг/мл мы получили 180 пг/мл. Подобная сходимость была получена и в отношении определения фолатов: при 16-20нг/мл - 18,5нг/мл, а при 2-4нг/мл - 3,5нг/мл. Кроме того, в нескольких образцах сыворотки определение витамина В12 было проведено нами и в центральном диагностическом центре. Результаты были сходными: 1070 пг/мл - в диагностическом центре и 1200 пг/мл у нас, 250 пг/мл в диагностическом центре и 225 пг/мл с нашим набором.

Всего определение витамина В12 и фолиевой кислоты было проведено в образцах крови 25-ти доноров и 250-ти больных с различными видами анемий. Средние значения витамина В12 в норме составило 700± 150 пг/мл (350-900), среднее значение фолиевой кислоты - 7,5± 2,3 нг/мл(5,8-10), что соответствует литературным данным.

У больных с железодефицитной анемией /ЖДА/ до лечения уровень витамина В12 составлял 926± 205,5 пг/мл, а после проведения ферротерапии при нормализации уровня Нв снизился до 276± 49,9 пг/мл Уровень фолатов до терапии был 15,6± 5,3 нг/мл, а после терапии - 9,0± 2,2 нг/мл. Данные результаты вполне логичны, поскольку эти витамины потребляются при синтезе гемоглобина. У больных с лимфопролиферативными заболеваниями наблюдались повышенные значения витамина В12, в отдельных случаях даже до 2000 пг/мл и пониженное содержание фолатов - до 2,5 нг/мл. У больных с миелопролиферациями отмечено понижение как витамина В12, так и фолиевой кислоты. Полученные нами результаты согласуются с литературными данными.

Таким образом, разработанная нами система для определения витамина В12 и фолатов на основе “открытого” иммуноферментного метода может быть использована при диагностике и динамическом лечении различных форм анемий.

Содержание конференции | Секция5