ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ И ГРУППОВОЕ ДНК-ЗОНДИРОВАНИЕ В ДИАГНОСТИКЕ ТУБЕРКУЛЕЗА

Н. Фельдман, Н. Эфрос

StripLab Ltd. Co., 556 Ave Z, #2H Brooklyn, NY,11223 USA

Фирма StripLab Ltd. Co. разрабатывает и выпускает биотехнологические продукты и субстанции для медицины, и биологии. Одним из главных направлений является разработка средств лабораторной диагностики распространенных заболеваний, в частности, туберкулеза.

Туберкулез - социально опасное заболевание, он уносит более 3 миллионов жизней в год, причем ежегодно регистрируется 8,6 миллионов вновь заболевших. Помимо роста заболеваемости в целом, постоянно возрастает доля случаев, вызванных мультирезистентными к лекарственным препаратам штаммами (МDR - multidrug resistаnсе). Одним из условий борьбы с туберкулезом является успешная диагностика. Необходимы современные способы обнаружения возбудителя, его идентификации и определения резистентности к лекарственным препаратам.

Для обнаружения микобактерий туберкулеза в предлагаемом диагностическом комплекте используется полимеразная цепная реакция (PCR). Этот метод превосходит все иные диагностические подходы по чувствительности (обнаруживается 1 молекула ДНК), высокоспецифичен и производителен. Собственно идентификация осуществляется путем генотипирования. Полученный в ходе PCR амплификат исследуется методом захвата зонда. При этом видоспецифичные последовательности обнаруживаются по образованию комплексов между искомой последовательностью (ДНК-мишень) и комплементарным ей зондом. Приоритетным направлением фирмы StripLab Ltd. Co. является создание и внедрение метода группового зондирования. При такой технологии один образец амплификата одновременно взаимодействует с любым необходимым количеством зондов, иммобилизованных в виде линий на нитроцеллюлозной полоске.

Основным методом лечения туберкулеза является длительная химиотерапия. В основе назначения той или иной комбинации лекарств должно лежать определение резистентности микобактерий к лекарственным препаратам. В случае МDR-туберкулеза своевременность и адекватность определения резистентности становится вопросом жизни и смерти больного. Маркером МDR является резистентность к рифампицину поскольку в 83% случаев МDR-штаммы характеризуются резистентностью к этому препарату.

Наиболее распространенным сегодня рутинным методом определения резистентности является оценка роста микобактерий при культивировании их на средах с добавлением лекарственных препаратов. При этом минимальное время установления чувствительности микобактерий к лекарственным препаратам составляет 1 - 3 месяца. В этот период пациент может получать совершенно неадекватное лечение. Принцип группового зондирования обеспечивает экспресс определение резистентности одновременно с идентификацией микобактерий.

Нуклеотидные последовательности - зонды иммобилизованы в виде поперечных линий на нитроцеллюлозных полосках Ряд зондов вместе составляет участок гена rроВ, кодирующий аминокислоты 509-535 бета-субъединицы РНК-полимеразы М. tuberculosis, являющийся мишенью для действия рифампицина, а ряд зондов соответствует известным мутациям в этом же участке приводящим к резистентности в отношении рифампицина. Кроме того, на полоску нанесен видоспецифичный зонд для идентификации М. tuberculosis и контроль (биотин). Исследуемый образец (мокрота, плевральный выпот или иные биоптаты) амплифицируют (РСR) с использованием меченых биотином праймеров, соответствующих данному участку генома М. Tuberculosis, входящих в диагностический комплект. Амплификат наносят на поверхность полосок. При этом происходит гибридизация биотинированной ДНК-мишени с иммобилизованными на полоске зондами. Замена хотя бы одного нуклеотида в последовательности нуклеотидов ДНК-мишени ведет к нарушению гибридизации с зондом, комплементарным соответствующему участку немутантной ДНК-мишени, но при этом происходит гибридизация с зондом, учитывающим эту замену. Если гибридизация имела место, то в ходе этого этапа поверхность полоски в месте нанесения зонда оказывается меченой биотином. Полоска инкубируется с конъюгатом (авидин-щелочная фосфатаза). В ходе инкубации авидин связывается с биотином и метит участки гибридизации щелочной фосфатазой. Обработка полоски хромогенным субстратом щелочной фосфатазы приводит к образованию видимой окраски. Таким образом, если исследуемый материал содержит микобактерии, чувствительные к рифампицину, визуализуются все линии соответствующему участку немутантной ДНК мишени и видоспецифичная линия М. tubrculosis. Если же имеют место те или иные мутации обусловливающие резистентность или наличествуют смешанные формы, то возникает соответствующая комбинация окрашенных и неокрашенных линий. Диагностический комплект обеспечивает следующие параметры обнаружения М. tuberculosis: чувствительность - 100%, спецфичность - 100%. Определение маркера резистентности: чувствительность - 100, специфичность 99%. Совокупные затраты времени на анализ около 4 часов (из них на амплификацию 2 часа). Генотипирование микобактерий указанным методом может использоваться в условиях любой клинической лаборатории.

Содержание конференции | Секция5